文章出处：
中国组织工程研究 第16卷 第35期 2012-08-26初版
齐进，黄萍，张连方，丰盛梅，邓廉夫
文章亮点：
①采用EXAKT切磨系统技术能制作出高质量的软、硬组织薄层切片。
②EXAKT 切磨系统可清晰显示各种组织结构和人工植入物。
文章概要: 
实验对做形态计量观察的骨标本和含金属植入物的软硬组织标本采用不脱钙有机玻璃包埋技术进行处理。实验采用EXAKT硬组织切磨系统制作皮质骨和含金属植入物的软硬组织切片，能获得厚薄均一的5-10μm薄切片。实验发现EXAKT硬组织切磨系统制作的薄切片在高倍镜下更容易聚焦，可清晰显示组织结构及荧光标记。
背景：
目前常用的Polycut 硬组织切片机难以制作皮质骨或含坚硬植入物组织的薄层切片，近年来这些切片多用EXAKT硬组织切磨系统进行制作。
目的：
实验采用EXAKT切磨系统制作含金属内植物的软、硬组织薄层切片。
方法：
取大鼠股骨远端、小鼠股骨干骨折部、带有钛金合金种植体的犬下颌骨和带有钴铬支架的猪冠状主动脉标本，经多聚甲醛固定和丙酮脱水后用有机玻璃（甲基丙烯酸甲酯）浸透包埋。组织包埋块用EXAKT系统作厚度约300μm的切片，然后磨片至5-10μm的切片。不同切片用苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下观察形态。
结果与结论：
甲苯胺蓝染色显示，大鼠股骨远端骨组织切片中干骺端矿化骨小梁呈浅蓝色、皮质骨结构完整，无碎裂。含带有钛合金种植体的犬下颌骨切片浅蓝色宿主骨与黑色金属种植体密切结合，形成牢固的界面。四环素标记的小鼠股骨干骨折部骨痂切片，在荧光显微镜（紫外光）下显示明显的双层荧光带。苏木精-伊红染色的包裹钴铬合金支架的猪冠状动脉组织切片显示，支架材料维持原味，与血管壁无脱离或游离现象，组织无皱纹或折叠。结果提示，采用EXAKT切磨系统技术能制作出高质量软、硬组织薄层切片，可清晰显示各种组织结构和人工植入物。
关键词：
EXAKT切磨系统；骨；植入物；有机玻璃；切片；骨组织构建

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对含荧光素标记的骨组织常用Polycut硬组织切片机进行切片，优点是能切5-10μm厚的切片，清晰显示骨结构和荧光标记[1-3]，缺点是切坚硬的皮质骨易发生骨碎裂，导致切片质量较差，并且不能切割金属植入物。因此，切皮质骨和含金属植入物的骨标本常用Leica菇切片机或慢速金刚环锯[4-6]。这些器械切出的切片较厚，常超过100μm，需要用磨片机甚至手工进行磨片[4-6]。这样摸出的切片厚度不一，甚至产生同意切片不同部位的厚薄不匀，导致镜下观察时难以聚焦，影响照片质量。对于这些常规设备难以制作的硬组织切片，目前多用德国EXAKT硬组织切磨系统进行制备[7-9]，这些切片能达到＜20μm的厚度，并保持硬组织，组织与植入物之间的原有组织结构形态。

实验室介绍采用EXAKT硬组织切磨系统制备皮质骨及含内植物软硬组织薄切片的计提方法及可能达到的效果。
1、材料和方法
设计：组织学实验。
时间及地点：于2008/2011上海市伤骨科研究所实验室收集。包括：①3月龄雌性SD大鼠的股骨远端组织标本。②含四环素双标记的3月龄小鼠股骨干骨折部骨痂组织标本。③含钛合金合金种植体的雄性犬下颌骨组织标本。④含植入钴铬合金支架的雄性猪冠状动脉组织标本。
主要试剂和仪器：

方法：
组织固定、脱水和包埋：新鲜组织块至于40g/L多聚甲醛固定液中固定48h后流水冲洗24h，在EXAKT 510脱水仪中用100%丙酮溶液脱水。脱水后将组织块植入塑料模具，在EXAK T520光固化包埋机中做有机玻璃包埋。

组织切片：有机玻璃聚合后去除塑料模具，用Technovit 4000黏合剂将有机玻璃包埋样本黏于载玻片A。将载玻片A真空吸附于EXAKT 300CP切片机夹具上，通过激光在包埋标本上定位，用金刚锯条切割暴露标本表面。将载玻片A吸附于EXAKT 400CS磨片机对标本表面进行抛光。在EXAKT 401载片黏合装置张用Technovit 7210VLC胶水将载玻片B合成一个类似于三明治的结构。将三明治结构的载玻片A侧吸附于EXAKT 300CP切片机夹具上，从载玻片B侧通过自动步进定位装置切割厚度约300μm的切片。

把黏附切片的载玻片B吸附于待滚动磨盘装置和电子测量控制系统的EXAKT 400CS微磨片装置，针对不同标本预先设定磨片的厚度。在各级SiC&Al?O?砂纸上磨片至预定厚度，最后用细砂纸对切片表面进行抛光。整个过程通过AW100测量控制系统进行控制。实验的切片最终厚度为5-10μm。
切片染色方法：
苏木精-伊红染色：将苏木精直接滴加于植入钴铬支架的猪冠状动脉切片组织表面，视标本类型掌握染色时间，通常5-30min，流水清洗残留染液后切片植入体积分数1%盐酸乙醇30S，流水冲洗后再入温水返蓝，而后进入伊红复染1min，自然干燥后直接用BASO病理封固胶封固，光学显微镜下观察组织形态。
甲苯胺蓝染色：将体积分数1%甲苯胺蓝染液直接滴加于大鼠股骨远端骨组织切片和含带有钛合金种植体的犬下颌骨切片表面5-30min(染色时间视标本类型而定)，流水冲洗，待自然干燥后直接用BASO病理封固胶封固。不染色切片直接用BASO病理封固胶封固，光学显微镜下观察各组组织形态。
采用免疫荧光染色观察小鼠股骨骨折骨痂组织形态，荧光显微镜下观察组织形态。
主要观察指标：各组染色标本内的显微结构，不同软硬组织切片的显示效果。

2、结果
2.1切片质量控制结果 各种骨标本及含内植物的软、硬组织标本，经有机玻璃包埋后，均可通过EXAKT切磨系统制作出5-10um厚的薄切片。由于磨片厚度经螺旋测微器自行测量，因此切片各部位厚度均一(差别不超过+0.01微米)，且切片表面光整。光镜下聚焦后各部位结果均能清晰显示。

2.2不同软硬组织切片的显示效果 甲苯胺蓝染色的大鼠股骨远端骨组织切片显示，切片中干骺端矿化骨小梁呈浅蓝色、而未矿化的骨小梁表面类骨质及骺板软骨基质呈深蓝色：浅蓝色的皮质骨结构完整，无碎裂，见图1。

四环素标记的小鼠股骨骨痂切片(未作其他染色)显示，在荧光显微镜(紫外光)下显示明显的双层荧光带，据此可测定新骨形成和骨改建，见图2。

甲苯胺蓝染色后的含螺纹状金属种植体的犬下颌骨切片显示，金属种植体保持在原位，浅蓝色宿主骨与黑色金属种植体密切结合，形成牢固的界面，见图3。

苏木精-伊红染色的包裹钴铬合金支架材料的猪冠状动脉组织切片显示，支架材料维持在原位，与血管壁无脱离或游移现象，组织无皱缩或折叠，见图4。

3、讨论
骨是一种坚硬的结缔组织，如做石蜡切片，需先进行脱钙。虽然脱钙骨切片常用于观察骨的细胞变化[10]，但脱钙过程可引起组织结构皱缩，影响骨结构的定量分析。更重要的是以四环素为代表的骨荧光标记物与新骨内钙盐鳌合[11-12]，脱钙可使荧光标记消失，影响对骨改建的动态分析。因此，对做形态计量观察的骨标本采用不脱钙有机玻璃包埋技术进行处理[13-14]。有研究对含金属植入物的骨标本也采取不脱钙技术进行处理[15]，主要有2个原因:①脱钙不能软化金属植入物。②脱钙引起的骨组织皱缩可引起骨-植入物界面分离，不能反映愈合过程中植入物与骨的结合情况。
虽然不脱钙的有机玻璃包埋能够维持硬组织(骨、牙)和金属植入物的形态结构完整性，但切片技术往往是保证观察质量的关键。最多用于硬组织切片的是德Polycut硬组织切片机，可切5-10μm的薄切片。除了实验研究外，该切片技术在临床上广泛用于髂骨活检标本[16-17]。
髂骨活检结果既是诊断骨质疏松和多种骨病的金标准，而且也是评判治疗效果的重要指标[18]。髂骨活检前一段时间服用2次四环素进行新骨双重标记，使新骨形成区有两条荧光条带[17-19]。骨结构和静态骨改建参数的测定在甲苯胺蓝染色切片上进行，而动态骨改建参数依靠在未染色切片上测量四环素荧光条带的长度和两条条带的间距。荧光标记在薄切片中的清晰度远优于厚切片。
然而，Polycut切片机适用于髂骨这类含大量松质骨和较疏松皮质骨的部位[20]，不适合切致密皮质骨，更不能切割坚硬的金属植入物。因此，许多研究采用慢速金刚环踞切割皮质骨或含金属植入物骨标本[5-6]。但用环踞切出的切片往往大于100μm，经磨片也只能达到50μm，而且磨片厚度不易掌握。这种厚片内的结构较难聚焦，尤其是骨内荧光标记，常会影响测试的精确性。目前越来越多学者用EXAKT硬组织切磨系统制作皮质骨和含金属植入物骨切片[7-9]。该系统对切、磨片厚度均可精确调控，最终片厚可达5-10μm，且厚度均一。实验发现用EXAKT硬组织切磨系统制备的薄层骨切片在显微镜下容易聚焦，由于切片各部位厚度均匀，较少出现聚焦困难的现象。因此，即使在高倍镜下也可显示清晰的骨结构和荧光标记。此外由于骨结构形态保持完好，该切片还适用于观察金属内植物与骨的界面情况，这对研究骨内植物的愈合具有重要意义。
对软组织作显微镜观察一般采用石蜡切片，但在植入钴铬合金支架的情况下石蜡切片不一定适用。原因是石蜡切片刀难以切动较硬的合金支架，硬切容易造成支架变形或碎裂。此外，支架和动脉组织硬度不一，在切片时容易造成2者分离。因此需要寻找一种新的方法来处理这种标本。实验对植入钴铬合金支架的猪冠状动脉采用硬组织切片方法进行处理取得了良好的效果。镜下显示支架及动脉结构完好，两者呈密切结合。本次实验结果提示对含有金属材料的软组织可用有机玻璃包埋方法。有机玻璃浸透可增加软组织的硬度，在切片时不易发生变形。对这种有机玻璃组织包埋块用 EXAKT硬组织切磨系统制作切片可获得满意的观察效果。因此，实验为观察含金属支架的软组织提供了一个有效的方法。
综上所述，EXAKT硬组织切磨系统适用于制作皮质骨和含金属内植物组织的薄层切片，这种切片可做各种染色进行定量组织形态观察，可广泛应用于骨科、口腔、肿瘤、心血管及整形外科等研究领域。

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